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柑桔黄龙病检测

发布时间:2015-03-12 00:30:25 浏览次数:

 

 

柑桔黄龙病检测-PCR技术

柑桔黄龙病是世界性的毁灭性病害。控制此病的关键在于:一、实行严格检疫,防止带病接穗及苗木传播;二、建立无病苗木基地,培育无病苗;三、及早铲除病株及防治柑桔木虱。这些方法的有效实施,迫切需要有一套快速、准确的检测技术相配合。由于黄龙病病原在病株体内(尤其是在未显症状的病株体内),浓度极低,以往的检测方法(包括化学法及血清学方法)灵敏度不高,不能检测出这样低浓度的病原。聚合酶链式反应

(Polymerase Chain Reaction,PCR)Saiki等人于1985年首创的一种DNA体外扩增技术,是体外酶促反应合成特异性DNA的一种方法。它是利用特异性的引物,在变温的条件下,可将极微量的目的DNA片段在几小时内扩增至百万倍,从而达到可以检测的目的。根据我们几年的试验证明,PCR法是目前快速、准确检测柑桔黄龙病病原的一种新技术。其检测程序及方法如下:


 

 

一、样品

DNA的提取

采用

CTAB(Murray et al 1980)提取样品的模板DNA。具体操作如下:取0.5克叶脉,剪碎,加液氮磨成粉末状,加入23倍体积的2CTAB(溴化十六烷基三甲基胺)抽提缓冲液,混匀,分装于Eppedorf管中,65℃水浴1小时,用苯酚/氯仿和氯仿/异戊醇抽提12次,取上清液,加入1/10体积3mol/L NaAC(即醋酸钠)(pH7.0)及2倍体积无水乙醇,置于-20℃过夜,于4℃以下16000/分离心20分钟,弃上清液,分别用70%及95%乙醇洗沉淀各1次,用风筒吹干并在室温放置5分钟,干燥DNA沉淀,加入100μL TE溶解DNA沉淀,取2μL1.2%琼脂糖凝胶上电泳,紫外灯下观察DNA的纯度并估算其浓度。其余置-20℃保存备用。

 

二、引物设计

PCR的引物根据柑桔黄龙病病原亚洲株系In2.6DNA序列(Villechanoux et al 1993)设计出引物1(P1)和引物2(P2),其扩增片段大小为535bp

三、

PCR扩增反应

PCR反应体系的总体积为50μL。反应体系包括10×PCR反应缓冲液5μL2mmol/L dNTP 5μLP1P21μL,模板DNA 2μL(每个反应为10ng),灭菌双蒸水35μL,最后加入TaqDNA 聚合酶1μL (3U/μL)混合后置于PCR仪上进入扩增反应。反应条件为:94℃变性5分钟后,按94℃变性1分钟→55℃退火1分钟→72℃延伸1分钟(最后1次需10分钟)的顺序,进行30次循环。

四、扩增产物的检测

 

PCR扩增产物10μL1.2g/L)琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下观察结果。只有感染了柑桔黄龙病病原的样品才能扩增到535bp特异性电泳区带,为扩增阳性(图1

 

 

五、

应用

PCR检测柑桔黄龙病的结果 不仅可以检测出已显症状的病苗及与病枝相邻的无症状枝条中有黄龙病存在,而且还能检测出在苗圃中已带病但尚未显症状的病株(图2)。因此,应用PCR技术对柑桔黄龙病进行早期诊断,能有效地防止病苗传播,这对培育柑橘无病苗及防治黄龙病都具有重要的应用价值。


 

( 华南农业大学 邓晓玲 唐伟文编撰 罗启浩审校 林伟振制作 版权所有 All Rights Reserved